Diseño de un panel multicolor para evaluar moléculas intracelulares y de superficie mediante citometría de flujo / Design of a multicolor panel to assess intracellular and surface molecules by flow cytometry

Introducción. La citometría de flujo permite detectar la presencia de moléculas intracelulares y de superficie, de forma simultánea sobre cada célula. Objetivo. Describir un método para la construcción armónica de un panel multicolor con 11 parámetros para el análisis fenotípico y funcional de linfocitos T (LT) CD8 + por citometría de flujo. Materiales y métodos. Para la construcción del panel multicolor, se seleccionaron las moléculas y se titularon los conjugados con fluorocromos para la determinación de CD3, CD8, CCR7, CD28, CD27, CD45RA, CD95 y CD127, en células mononucleares de sangre periférica. Para la evaluación del panel, se hizo la construcción progresiva adicionando uno a uno los conjugados y la fluorescencia menos uno (FMO). Este método fue aplicado para células ex vivo y para evaluar la producción de IFN ? , IL-2 y TNFa frente al estímulo con la enterotoxina B de Staphylococcus aureus (SEB) y al antígeno crudo de Trypanosoma cruzi . Finalmente, se procedió al análisis de las subpoblaciones de LT CD8 + ex vivo en individuos sanos. Resultados. La evaluación de las moléculas con los conjugados no mostró interferencia en las señales de fluorescencia. Las frecuencias de las subpoblaciones de LT CD8 + evaluadas fueron cercanas a los valores reportados en otros estudios. Además, se observó que la frecuencia de LT CD8 + productores de IFN ? , IL-2 y TNFa fue mayor a las seis horas de cultivo con SEB y con el antígeno crudo de T. cruzi . Conclusiones. El método aplicado para la construcción del panel multicolor permite obtener frecuencias de las subpoblaciones de LT CD8 + que corresponden a lo reportado en la literatura científica.

Introduction: Flow cytometry allows simultaneous detection of surface and intracellular molecules on each cell. Objective: To describe a method for building up a harmonic multicolor panel with 11 flow cytometry parameters for phenotypic and functional analysis on CD8 + T lymphocytes. Materials and methods: For the multicolor panel construction, we selected the molecules and titred conjugated antibodies with fluorochromes for CD3, CD8, CCR7, CD28, CD27, CD45RA, CD95 and CD127 determination in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). To evaluate the panel, the conjugated antibodies were gradually added one by one and fluorescence minus one (FMO) test was performed. This method was applied to assess ex vivo subpopulations of T cells and the production of intracellular IFN ? , IL-2 and TNF a using polyclonal stimulation with enterotoxin B from Staphylococcus aureus (SEB) and antigen-specific cells with crude Trypanosoma cruzi antigen. Finally, the ex vivo CD8 + T lymphocyte subpopulations frequencies were analyzed in healthy individuals. Results: The evaluation of the selected molecules and conjugates did not show interference in the fluorescence signals and detection. The frequencies of CD8 + T cells evaluated were similar to the values reported in other studies. Additionally, we observed that the frequency of CD8 + T lymphocytes producing IFN ? , IL-2 and TNF a was higher 6 hours after culture with SEB and crude T. cruzi lysate. Conclusions: The method used for the construction of a multicolor panel allows obtaining frequencies of CD8 + T lymphocyte subpopulations corresponding to those reported in the literature.

A human astrocytoma cell line is highly susceptible to infection with Trypanosoma cruzi

Astrocytes play a vital role in neuronal protection, homeostasis, vascular interchange and the local immune response. Some viruses and parasites can cross the blood-brain barrier and infect glia. Trypanosoma cruzi, the aetiological agent of Chagas disease, can seriously compromise the central nervous system, mainly in immune-suppressed individuals, but also during the acute phase of the infection. In this report, the infective capacity of T. cruzi in a human astrocyte tumour-derived cell line was studied. Astrocytes exposed to trypomastigotes (1:10 ratio) produced intracellular amastigotes and new trypomastigotes emerged by day 4 post-infection (p.i.). At day 6 p.i., 93% of the cells were infected. Using flow cytometry, changes were observed in both the expression of major histocompatibility complex class I and II molecules and the chemokine secretion pattern of astrocytes exposed to the parasite. Blocking the low-density lipoprotein receptor on astrocytes did not reduce parasite intracellular infection. Thus, T. cruzi can infect astrocytes and modulate the immune response during central nervous system infection.

Expression of inhibitory receptors on CD4+ and CD8+ T cells from healthy Colombian donors / Expresión de receptores Inhibidores en linfocitos T CD4+ y CD8+ de donantes sanos Colombianos / Expressão de receptores inibitórios sobre linfócitos T CD4+ e CD8+ de doadores saudáveis Colombianos

T cell activation involves positive cellular signals that promote effector functions and negative signals that contribute to the regulation of these responses. These regulatory signals are generated upon activation of receptors on T cells that include CD160, 2B4, Programmed Death-1 and CTLA-4. Objective. To evaluate the expression of inhibitory receptors like CD160, 2B4, Programmed Death-1 and CTLA-4 on CD4+ and CD8+ T cells from healthy Colombian donors. Materials and methods. Peripheral blood mononuclear cells from 30 healthy donors from Bogotá (Colombia) were obtained via Ficoll-Hypaque density gradient and cells were stained with specific conjugated antibodies previously titrated. Results. The CD160, 2B4, and Programmed Death-1 inhibitory markers were detected on CD4+ T cells with expression levels of 0.35%, 1.04%, and 1.35%, respectively. On CD8+ T cells, these markers were expressed at higher levels: 16%, 8.97%, and 4.3%, respectively. In contrast to the other receptors, CTLA-4 frequency of expression showed no significant difference between CD4+ (1.56%) and CD8+ (1.53%) T cells. Frequency of CD160/2B4 and CTLA-4/ Programmed Death-1 coexpression was 0.18% and 0.09% on CD4+ cells, and 4.02% and 0.2% on CD8+ T cells. Conclusions. This is the first report showing the frequency of inhibitory receptors such as CD160, 2B4, Programmed Death-1, and CTLA-4 on CD4+ and CD8+ T cells from healthy Colombian donors. Our findings serve as a baseline for the analysis and comparison of these receptors in Colombian populations with different disease conditions.

La activación de células T involucra señales positivas que promueven funciones efectoras y señales negativas que contribuyen a la regulación de la respuesta inmune. Estas actividades regulatorias son generadas por la activación de receptores de las células T e incluyen moléculas como CD160, 2B4, PD-1 y CTLA-4. Objetivo. Evaluar la expresión de los receptores inhibitorios CD160, 2B4, PD-1 y CTLA-4 en células T CD4+ y CD8+ de donantes sanos colombianos. Materiales y métodos. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica de 30 donantes sanos provenientes de Bogotá (Colombia) mediante gradiente de densidad por Ficoll-Hypaque, las células fueron marcadas con anticuerpos conjugados a fluorocromos previamente titulados. Resultados. CD160, 2B4, y PD-1 presentaron porcentajes de expresión en células T CD4+ de 0.35%, 1.04% y 1.35% respectivamente. En células T CD8+ estos receptores mostraron niveles de expresión más altos con porcentajes de 16.3%, 8.97% y 4.3% respectivamente. A diferencia de los otros receptores, CTLA-4 no mostró diferencias entre células T CD4+ (1.56%) y CD8+ (1.53%). Los porcentajes de co-expresión de CD160/2B4 y CTLA-4/PD-1 en células T CD4+ fueron de 0.18% y 0.09%, en células T CD8+ se observaron porcentajes de expresión de 4.02% y 0.2%. Conclusión. Este es el primer reporte que muestra la frecuencia de expresión de receptores inhibitorios tales como CD160, 2B4, PD-1 y CTLA-4 en células T CD4+ y CD8+ de donantes sanos colombianos. Estos hallazgos representan una línea de base para el análisis y la comparación de estos receptores en la población colombiana con diferentes enfermedades.

A ativação de células T envolve sinais positivos que promovem funções efetoras e sinais negativos que contribuem para a regulação da resposta imune. Estas atividades reguladoras são geradas através da ativação de receptores de células T e incluem moléculas tais como CD160, 2B4, PD-1 e CTLA-4. Objetivo. Avaliar a expressão de receptores inibitórios CD160 e 2B4, PD-1 e CTLA-4 em células T CD4+ e CD8+ de doadores saudáveis colombianos. Materiais e métodos. Foram obtidas células mononucleares do sangue periférico de 30 doadores saudáveis provenientes de Bogotá (Colômbia) a partir de gradiente de densidade por Ficoll-Hypaque, as células foram marcadas com anticorpos conjugados com fluorocromos previamente titulados. Resultados. CD160, 2B4, e PD-1 mostraram percentagens de expressão em células T CD4+ de 0,35%, 1,04% e 1,35%, respectivamente. Em células T CD8+ estes receptores mostraram níveis de expressão mais elevados com percentagens de 16,3%, 8,97% e 4,3% respectivamente. Ao contrário de outros receptores, CTLA-4 não apresentou diferenças entre células T CD4+ (1,56%) e CD8+ (1,53%). As percentagens de co-expressão de CD160/2B4 e CTLA-4/PD-1 em células T CD4+ foram de 0,18% e 0,09%; em células T CD8+ foram observadas percentagens de expressão de 4,02% e 0,2%. Conclusão. Este é o primeiro relatório que apresenta a frequência de expressão de receptores inibitórios tais como CD160, 2B4, PD-1 e CTLA-4 em células T CD4+ e CD8+ de doadores saudáveis colombianos. Estes resultados representam uma linha de base para análise e comparação desses receptores na população colombiana com diferentes doenças.

Seguimiento de pacientes con enfermedad de chagas y trasplante de corazón mediante las PCR S35-S36 y TcH2AF-R / Using S35-S36 and TcH2AF-R primer-based PCR tests to follow-up a Chagas’ disease patient who had undergone a heart transplant

Introducción. La cardiomiopatía es la forma clínica más común de la enfermedad de Chagas en Colombia, siendo el trasplante una opción para su tratamiento. Debido al riesgo de reactivación de la infección posterior al trasplante, es prioritario vigilar el comportamiento del parásito. Objetivo. Presentar el caso de un paciente con cardiopatía chagásica dilatada y falla cardiaca, a quien se le practicó trasplante de corazón y se le hizo seguimiento mediante PCR, análisis histopatológicos y ecocardiográficos. Materiales y métodos. Se tomaron muestras de sangre antes de la intervención y después de ella y de biopsias endomiocárdicas posteriores al trasplante. El ADN extraído fue amplificado con los iniciadores TcH2AF-R y S35-S36. La parasitemia se examinó mediante la técnica de microhematocrito. Se practicaron estudios histopatológicos para determinar la presencia del parásito o el rechazo del trasplante y, ecocardiográficos, para evaluar la función cardiaca. Resultados. De las muestras de sangre tomadas a los 83 y 48 días previos al trasplante, la última fue positiva por la PCR S35-S36. Hasta el segundo mes después del trasplante, ambas PCR fueron negativas. Al tercer mes después del trasplante, ambas PCR fueron positivas, por lo cual se inició tratamiento con nifurtimox. Tras 35 días de haberse iniciado el tratamiento, ambas pruebas presentaron resultados negativos, al igual que las tomadas a los 0, 3, 10 y 12 meses posteriores. Los resultados de la histopatología, del microhematocrito y de las PCR de las biopsias, fueron negativos en todas las fechas. Conclusiones. Las PCR permitieron sospechar la reactivación de la infección en el paciente, se le administró el tratamiento y posterioremente las pruebas se tornaron negativas. La evolución clínica del paciente ha sido favorable.

Introduction. Cardiomyopathy is the most common clinical form of Chagas’ disease in Colombia, and one treatment option is a heart transplant. Tracking the behavior of the Chagas’ parasite, Trypanosoma cruzi, is a priority due to the risk of post-transplant reactivation of the infection. Objective. A case is presented of a patient who had suffered from dilated chagasic cardiopathy and cardiac failure, and had subsequently undergone heart transplant. The case was monitored by PCR, histopathological and echocardiographic examinations. Materials and methods. Blood samples were drawn before and after the transplant, and post-transplant endomyocardial biopsies were taken. The extracted DNA was amplified with the TcH2AF-R and S35-S36 primers. Parasitemia was examined by the microhematocrit test. In addition, histopathological studies determined the parasite presence and transplant rejection status. Echocardiograms were administered to evaluate cardiac function. Results. Of the blood samples taken 83 and 48 days pre-transplant, the latter was positive by the S35-S36 PCR test. PCR tests in blood with both primers were negative up to the second month post-transplant. However, both PCR tests were positive by the third month post-transplant. Thereupon, the patient was treated with nifurtimox. Both tests presented negative results in blood 35 days after treatment was started and remained negative thereafter at 0, 3, 10 and 12 months post-treatment. The pathology, microhematocrit, and PCR test results from biopsies were negative on all the specified dates. Conclusions. PCR tests were used as indicators of a reactivation of trypanosomid infection in the patient. After treatment administration, PCR tests became negative. The patient’s clinical evolution was favorable.

Secuencia parcial del genoma del maxicírculo de Leishmania braziliensis, comparación con otros tripanosomátidos / Maxicircle genome partial sequence of Leishmania braziliensis: assembling and comparison with other trypanosomatids / Seqüência do genoma parcial do maxicirculo de Leishmania braziliensis: montagem e comparação com outros tripanossomatídeos

Objetivo. Con el fin de aportar nueva información relevante para estudios de genotipificación y filogenética del género Leishmania, en este estudio se determinó y comparó la secuencia del maxicírculo de Leishmania braziliensis, cepa MHOM-BR-75-M2904, con las secuencias del maxicírculo reportadas para otras especies de tripanosomátidos. Materiales y métodos. La búsqueda de las secuencias del maxicírculo se realizó en las bases de datos de secuencias no ensambladas del GeneDB versión 2.1, así como en el GenBank, utilizando los genes ND8 y RPS12 de L. braziliensis como sonda inicial. Estas secuencias se ensamblaron y se compararon con sus homólogas en otros tripanosomátidos mediante el uso de herramientas bioinformáticas como LALIGN y ClustalW2. El tamaño total del maxicírculo se determinó mediante ensayos de Southern blot. Resultados. Se ensamblaron dos fragmentos del maxicírculo de L. braziliensis de 6535 y 4257 nucleótidos, cuyos genes presentaron elevada sintenia y similitud en sus secuencias con los previamente reportados en otras especies de Leishmania. Similitud que se extiende incluso a los patrones de edición de estas moléculas. Conclusiones. A pesar de ser L. braziliensis la especie más divergente del género Leishmania en cuanto a su genoma nuclear, el marxicírculo presenta una elevada conservación. Resultado que sugiere que el patrón de edición presente en las diferentes especies de Leishmania hasta ahora estudiadas se conserva también en el subgénero Viannia, lo que indica una elevada conservación en la edición de los transcritos mitocondriales a nivel de género.

Objective. With the aim to provide new insights for genotyping and phylogenetic studies of the Leishmania genus, in this study the sequence of the maxicircle in Leishmania braziliensis, strain MHOM-BR-75-M2904, was determined and compared with those reported in other trypanosomatids species. Materials and methods. Searches for maxicircle sequences were performed in the unassembled sequences of GeneDB database version 2.1, as well as in the GenBank, using the ND8 and RPS12 genes of L. braziliensis as the initial probes. These sequences were assembled and compared with the homologous sequences of trypanosomatids using the bioinformatics tools LALIGN and ClustalW2. The size of maxicircle was determined by Southern blot assays. Results. Two maxicircle fragments of 6535 and 4257 nucleotides were assembled. The sequences of these genes showed high synteny and similarity with the sequences in other Leishmania species. This similarity even was extended to the editing patterns of these molecules. Conclusions. Although L. braziliensis is the most divergent species of the Leishmania genus in their nuclear genome, the maxicicircle has a high conservation. This result suggests that the pattern of editing present in the different Leishmania species studied has been conserved also in the subgenus Viannia. These results indicate a high conservation in the editing of mitochondrial transcripts at the genus level.

Objetivo. Com o fim de contribuir nova informação relevante para estudos de genotipagem e filogenética do género Leishmania, neste estudo determinou-se a sequência do maxicirculo de Leishmania braziliensis, cepa MHOM-BR-75-M2904, comparandosecom as seqüências do maxicirculo reportadas para outras espécies de tripanossomatídeos. Materiais e Métodos. A busca das seqüências do maxicirculo foi realizada nas bases de dados para seqüências não alinhadas no GeneDB versão 2.1, assim como no GeneBank, utilizando o genes ND8 e RPS12 de L. braziliensis como sonda inicial. Essas seqüências foram alinhadas e comparadas com as suas homologas em outros tripanossomatídeos, mediante o uso de ferramentas bioinformáticas como L-ALIGN e ClustalW2. O tamanho total do maxicirculo foi determinado mediante ensaios de Southern blot. Resultados. Foram alinhados dois fragmentos do maxicirculo de L. braziliensis de 6535 e 4257 nucleotídeos, cujos genes apresentaram elevada sintenia e similaridade nas suas seqüências com os genes previamente reportados nas outras espécies de Leishmania. A similaridade vista estende-se, inclusive, aos padrões de edição para estas moléculas. Conclusões. Apesar de L. braziliensis ser a espécie mais divergente do gênero Leishmania, no que se refere ao seu genoma nuclear, o maxicirculo apresenta uma alta conservação. Esse resultado sugere que o padrão de edição apresentado nas espécies de Leishmania até agora estudadas, é conservado também no subgênero Viannia, o que indica uma alta conservação na edição dos transcritos mitocôndriais ao nível de gênero.

Evaluación de las pruebas de PCR TcH2AF-R y S35-S36 para la detección de Trypanosoma cruzi en tejido cardiaco de ratón / Evaluation of TcH2AF-R and S35-S36 primers in PCR tests for the detection of Trypanosoma cruzi in mouse cardiac tissue

Introducción. El trasplante es una opción terapéutica en la cardiomiopatía chagásica. Para la detección temprana de una posible reactivación de la infección, se propone el uso de pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de biopsias endomiocárdicas; el modelo de ratón es una aproximación preliminar para evaluar la aplicación de éstas. Objetivo. Evaluar la aplicación de las pruebas de PCR basadas en los iniciadores TcH2AF-R y S35-S36 para la detección de T. cruzi en tejido cardiaco de ratones infectados con el parásito. Materiales y métodos. Se infectaron por vía intraperitoneal dos grupos de ratones ICR de 15 y 10 individuos con 0,3 ml de PBS que contenían 1x106 tripomastigotes de la cepa MHOM/CO/2001/D.A. (T. cruzi I) o 1x104 tripomastigotes de la cepa MHOM/BR/00/Y (T. cruzi II), respectivamente. El seguimiento de la parasitemia se realizó mediante microhematocrito y presencia de parásitos en el corazón a los 30, 60 (modelo agudo), 100 y 150 (modelo crónico) días por medio de histopatología y de las PCR TcH2AF-R y S35-S36. Resultados. La histopatología mostró alteraciones en el miocardio y presencia de amastigotes en los modelos agudo y crónico. En contraste al microhematocrito y al análisis histopatológico, la PCR S35-S36 permitió la detección de ambas cepas del parásito. La PCR TcH2AF-R detectó la cepa T. cruzi I con un desempeño superior al microhematocrito y al análisis histopatológico. Conclusiones. El uso de ambas pruebas de PCR puede ser útil en la confirmación de la reactivación de la infección postrasplante.

La región intergénica del gen H2A apoya las subpoblaciones KP1(-) y KP1(+) de Trypanosoma rangeli / The intergenic region of the histone h2a gene supports two major lineages of Trypanosoma rangeli

Introducción. Con base en la amplificación del ADN de los minicírculos del cinetoplasto y de los genes miniexón, Trypanosoma rangeli ha sido clasificado en las subpoblaciones KP1(-) y KP1(+). Objetivo. Comparar la región intergénica de los genes H2A entre cepas KP1(+) y KP1(-) de T. rangeli, con el fin de aportar evidencias a dicha división. Materiales y métodos. Se amplificó, clonó y determinó la secuencia de la región intergénica de los genes h2a de las cepas KP1(-) Tre y 5048 y de la cepa Choachí [KP1(+)]. Dichas secuencias, junto con las reportadas para las cepas C23 [KP1(-)] y H14 [KP1(+)], fueron utilizadas para la reconstrucción de árboles filogenéticos basados en los métodos de neighbor-joining, máxima parsimonia y máxima verosimilitud, utilizando la cepa Y de Trypanosoma cruzi como grupo raíz externo. Resultados. Se evidenció heterogeneidad intraespecífica en el tamaño de la región estudiada, soportados por valores bootstrap de 85 por ciento (neighbor-joining), 66 por ciento (máxima parsimonia) y 57 por ciento (máxima verosimilitud), los resultados indican que las cepas KP1(-) se agrupan aparte, claramente diferenciadas de las cepas KP1(+), las cuales presentan una mayor heterogeneidad intraespecífica en tamaño y secuencia. Además, se encontró mayor proximidad filogenética entre T. rangeli y T. cruzi que entre T. rangeli y Trypanosoma brucei. Conclusiones. Los análisis filogenéticos basados en la región intergénica de los genes h2a de las cepas estudiadas apoyan la división de T. rangeli en las subpoblaciones KP1(-) y KP1(+). Sin embargo, se requiere estudiar un mayor número de cepas para confirmar estos hallazgos.

Introduction. Trypanosoma rangeli has been classified in the KP1(+) and KP1(-) subpopulations, based on the mini-exon gene and kinetoplast DNA minicircle amplification profiles. Objective. The intergenic region of the histone h2a gene was compared between KP1(+) and KP1(-) strains of T. rangeli to substantiate this classification. Materials and methods. The amplification, cloning and sequencing of the h2a gene intergenic region was undertaken for the Tre and 5048 [KP1(-)] strains for comparison with the Choachí [KP1(+)] strain. These sequences, along with those previously reported for the KP1 (+) and KP1 (-) H14 and C23 strains, were used to reconstruct phylogenetic trees based on the “neighborjoining”, maximum parsimony and maximum likelihood methods. The Y strain of Trypanosoma cruzi was chosen as the outgroup. Results. Intra-specific heterogeneity was observed in the size of the gene region under study, supported by bootstarp values of 85% (neighbor-joining), 66% (maximum parsimony) and 57% (maximum likelihood). The KP1(-) strains were grouped apart, clearly differentiated from the KP1(+) strains. The latter demonstrated a higher intra-specific heterogeneity, both in sequence length and composition. In addition, a closer phylogenetic relationship between T. rangeli and T. cruzi was found to be more closely related to one another than to T. rangeli and Trypanosoma brucei. Conclusion. Phylogenetic analyses of analyzed strains based on the intergenic region of the h2a genes supported the T. rangeli grouping in two major subpopulations known as KP1(+) and KP1(-) strains. However, a higher number of strains are needed to confirm this finding.

Detection of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli infection in triatomine vectors by amplification of the histone H2A/SIRE and the sno-RNA-C11 genes

Trypanosoma rangeli is non pathogenic for humans but of important medical and epidemiological interest because it shares vertebrate hosts, insect vectors, reservoirs and geographic areas with T. cruzi, the etiological agent of Chagas disease. Therefore, in this work, we set up two PCR reactions, TcH2AF/R and TrFR2, to distinguish T. cruzi from T. rangeli in mixed infections of vectors based on amplification of the histone H2A/SIRE and the small nucleolar RNA Cl1 genes, respectively. Both PCRs were able to appropriately detect all T. cruzi or T. rangeli experimentally infected-triatomines, as well as the S35/S36 PCR which amplifies the variable region of minicircle kDNA of T. cruzi. In mixed infections, whereas T. cruzi DNA was amplified in 100 percent of samples with TcH2AF/R and S35/S36 PCRs, T. rangeli was detected in 71 percent with TrF/R2 and in 6 percent with S35/S36. In a group of Rhodnius colombiensis collected from Coyaima (Colombia), T. cruzi was identified in 100 percent with both PCRs and T. rangeli in 14 percent with TrF/R2 and 10 percent with S35/S36 PCR. These results show that TcH2AF/R and TrF/R2 PCRs which are capable of recognizing all T. cruzi and T. rangeli strains and lineages could be useful for diagnosis as well as for epidemiological field studies of T. cruzi and T. rangeli vector infections.

Embora o Trypanosoma rangeli não seja patogênico para o homem, sua importância médica e epidemiológica reside no fato de compartilhar vetores, reservatórios e áreas geográficas com o Trypanosoma cruzi, agente causal da Doença de Chagas. Neste estudo, para distinguir T. cruzi de T. rangeli em vetores com infecções mistas, se utilizaram duas amplificações de PCR; TcH2AF/R para o gen da histona H2A/SIRE e TrFR2, para um gen repetitivo de ARN nucleolar Cl1 (sno-RNA-Cl1). Assim como a PCR S35/S36, ambas as reações foram capazes de detectar corretamente a presença de T. cruzi ou T. rangeli em triatomíneos infectados experimentalmente. Nas infecções mistas, o ADN de T. cruzi foi amplificado em 100 por cento das amostras quando se utilizaram TcH2AF/R e S35/S36, enquanto T. rangeli foi detectado em 71 por cento delas com os iniciadores TrF/R2 e em 6 por cento, com S35/S36. Adicionalmente, em um grupo de Rhodnius colombiensis coletados na região de Coyaima (Tolima), T. cruzi foi identificado em 100 por cento com ambas PCRs e T. rangeli em 14 por cento delas com os iniciadores TrF/R2 e em 10 por cento, com S35/S36. Estes resultados mostram que as reações de PCR TcH2AF/R e TrF/R2, capazes de reconhecer todas as cepas e linhagens de T. cruzi e T. rangeli, podem ser úteis no diagnóstico e também nos estudos epidemiológicos do campo com vetores infectados pelo T. cruzi e T. rangeli.